检测食品(包括大豆)中的过敏原与食品标签要求有关。此外，过敏原特异性方法可以使食物基质中的过敏原标准化，以便作为过敏诊断方法用于食物挑战。快速方法是首选筛选和沿生产线。此前，我们通过结合环介导等温扩增(LAMP)和侧流装置(LFD)样可视化技术，证明了大豆DNA的敏感性和特异性检测。然而，长时间的DNA提取和先前的LAMP反应对后续的潜在污染可能会影响其作为快速和可靠的方法的使用。在这里，我们开发了一种快速提取DNA的方案。此外，我们确定酚红在永久封闭的反应管中具有明显的正反应可视化。用已知大豆含量的复杂食品(煮香肠、速溶汤和巧克力)对优化方法进行了验证。此外，在12种加工零售食品中显示了其适用性。结果经正交qPCR验证。改进后的LAMP方法可以在每公斤加工食品中检测到10毫克或以下的大豆。该方法提供快速和易于使用的筛选，而不需要检测设备。因此，它可以用于验证大豆成分的存在，并支持在复合食品中对非成分大豆进行基于风险的预防性标签。此外，由于确定过敏原免疫治疗(AIT)前后的临床反应阈值既是临床试验的纳入标准和排除标准，也是AIT的成功参数，因此该方法可以验证激发餐中可计算的大豆含量，从而对AIT前后的阈值测定进行标准化管理。
大豆(Glycine max)过敏是常见的，在过敏者中可导致不良反应，有时甚至危及生命[1,2]。罪魁祸首食物的口腔刺激是验证食物过敏(如大豆)的最终临床诊断程序[3]，所谓的双盲安慰剂对照食物刺激(DBPCFC)被认为是诊断食物过敏的“金标准”[4]。在明确诊断出对大豆过敏后，避免食用大豆食品仍然是预防过敏反应的最有效方法，因为大豆过敏的致病免疫疗法一直缺乏。为了支持对大豆过敏的个体进行安全的食品选择，大豆特异性检测方法对于验证大豆成分的正确标签和支持基于风险的预防性标签方法至关重要，该方法涉及意外和不可避免的非成分过敏原(过敏原交叉接触，例如在储存、制造或包装过程中)的存在[5]。此外，针对致敏性食品的分析方法可以帮助验证和质量保证诊断性食品基质，如DBPCFC中使用的，由活性(含有致敏性食物)和安慰剂(不含致敏性食物)膳食组成[6,7,8]。
检测致敏食物可以通过检测致病食物的特定蛋白质或DNA来完成。直接测定致敏蛋白最常见的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)和基于肽的质谱分析(MS)[5]。如果食品过敏原鉴定的目的是检测某一特征DNA序列，聚合酶链反应(PCR)是首选方法[5]。然而，这些强大而可靠的方法耗时长，部分成本高，需要一系列的实验室设备和合格的人员。因此，它们仅适用于需要简单快速分析的有限范围，例如食品生产过程中过敏原的现场调查。
基于抗体的快速检测，如侧流装置(lfd)已成为过敏原检测的重要工具，但特异性问题与基于抗体的ELISA相似[9,10,11]。此外，在高靶蛋白浓度下，可能会出现不良的钩效应，导致假阴性结果，尽管过敏食物的浓度很高[12,13]。由于DNA序列的复杂性高于蛋白质序列，基于DNA的方法具有高特异性的优势。此前，我们描述了一种针对多拷贝基因线粒体开放阅读框160b (ORF 160b)的高灵敏度和大豆特异性方法。这种环介导的大豆DNA等温扩增(LAMP)没有显示出随后在LFD中检测到的扩增产物的钩效应[14,15]。此外，用替代技术替代基于抗体的方法遵循3R原则(替代、减少、改进)，以减少动物实验[16]。基于lamp的检测具有敏感性、特异性和3r方法学的所有优点，已成为临床诊断中不可或缺的一部分[17,18,19]。在食品过敏原分析领域，迄今为止应用较少[15,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29]。
如果从样品制备到目标检测的总分析时间很短，并且结果可以快速检测到，例如通过LFD分析中条带的视觉外观或反应管中的比色染色，LAMP作为直接现场过敏原筛选的快速测试的潜在用途就可以实现。在我们之前发表的大豆LAMP-LFD[14,15]中，DNA提取方案仍然包括复杂的步骤:用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)热裂解1小时，随后用氯仿和异丙醇纯化，隔夜溶解沉淀的DNA，然后使用市售试剂盒进一步纯化DNA。因此，耗时的DNA提取方法阻碍了LAMP快速检测大豆过敏原的时间效率。此外，使用LFD作为检测方法需要打开放大管。因此，如果扩增和检测的步骤没有在空间上与DNA提取和LAMP设置分开，就不能排除扩增子可能污染测试环境的风险，这可能导致随后的LAMP反应出现假阳性结果。虽然DNA扩增中关键步骤的分离是最先进的，但避免扩增子释放是DNA扩增方法可靠和可重复使用的额外安全措施。
通过这项工作，我们的目标是改进LAMP作为一种快速和潜在的现场大豆检测方法，显著减少提取时间，并优化检测策略，避免打开反应管。为了解决这两个问题，研究了各种快速提取方法和不同的检测染料在封闭反应管中进行定性视觉检测。在对不同方法的功能、时间和结论性进行评估后，确定了性能最佳的方法，并对含有已知量大豆的食品基质进行了性能验证。因此，其适用性在零售食品样品中得到了体现。
食品基质、煮香肠、速溶番茄汤和黑巧克力的生产，均采用了大豆，以及12种商业大豆产品的采购在前面有描述[15]。在每公斤基质中添加100毫克、101毫克、102毫克、103毫克、104毫克和105毫克不同水平的大豆之前，使用凝集素qPCR对食品基质进行大豆阴性检测[30]。所有食品样品均匀浆并在- 20℃保存至测试。
为了与快速DNA提取方案进行比较，我们使用我们内部精心设计的CTAB提取方案从食品基质中纯化DNA[14]。简单地说，将100 mg样品裂解，用1.4 mL CTAB缓冲液(55 mM CTAB, 1400 mM NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris, pH 8.0)和20μL蛋白酶K在65℃下提取DNA，用氯甲烷纯化上清，用异丙醇和贻贝糖原沉淀可溶性DNA，用70%乙醇洗涤并干燥。在100μL TE缓冲液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)中重悬过夜，然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)进行纯化。
对以下快速方法和商用试剂盒进行了测试:使用纤维素滤纸的30秒试纸法[31]，EchoLUTION植物DNA试剂盒(BioEcho Life Science, K?ln，德国)和EchoCLEAN DNA清理试剂盒(BioEcho Life Science)结合先前广泛的CTAB裂解，根据Allg?wer等人[14]。为此，用CTAB缓冲液和蛋白酶K在65℃和1000 rpm下提取样品中的DNA 1 h，然后在13200 rpm下离心5 min(根据Allg?wer等人的CTAB裂解)，然后将上清液用于EchoCLEAN DNA清理试剂盒中。此外，FastPrep-24高速台式快速裂解均质机(MP Biomedicals, Eschwege, Germany)结合SureFood PREP高级试剂盒，协议1 (R-Biopharm, Pfungstadt, Germany)分别根据出版物和制造商说明中给出的详细信息进行测试。不同方法的示意图见图1。
被试提取方法CTAB、30 s试纸、EchoLUTION、EchoCLEAN和FastPrep-24方法示意图
匀浆后的样品材料(100±2mg)用580μL裂解缓冲液和20μL SureFood Prep Advanced kit (R-Biopharm)的蛋白酶K、裂解基质头和约。1.5 mg海砂，使用高速台式均质机(FastPrep-24和Lysing Matrix a, MP Biomedicals)。在常温下，裂解速度为6.5 m/s，裂解时间为60 s。随后根据制造商的说明(R-Biopharm)按照方案1使用SureFood Prep Advanced试剂盒对释放的DNA进行纯化。
不使用SYBR Green，而是将钙黄素(Carl Roth, Karlsruhe, Germany)[32]、中性红(Carl Roth)或酚红(Carl Roth)[33]加入到先前Allg?wer等人[14,15]中描述的LAMP主混合物中，并根据应用和公布的染料浓度调整超纯水的量。制备Miyamoto等人[34]中描述的结晶紫(Carl Roth)溶液，在200μL反应管中冻干，并用于Allg?wer等人[14]中描述的LAMP主混合物中。此外，根据制造商的说明(New England Biolabs, Frankfurt am Main, Germany)对商用主混合液WarmStart Colorimetric LAMP 2X主混合液进行了测试。
将提取的5微升DNA加入20μL的主混合物中，其中含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP各1.4 mM (Carl Roth)， 10 mM (NH4)2SO4 (Merck, Darmstadt, Germany)， 8 mM MgSO4 (New England Biolabs)， 50 mM KCl (Carl Roth)， 0.1% v/v Tween?20 (VWR, Darmstadt, Germany)， 100μM酚红(Carl Roth)， 0.32 U/μL Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(New England Biolabs)和之前发表的引物(每个正向F3和反向B3引物0.2μM);每种FIP和生物素-FIP引物0.8μM;1.6μM BIP引物;0.3μM LoopF引物;0.1μM FITC-LoopF引物;0.4μM LoopB引物)[14]。开始ph值调整到大约。在加入DNA和聚合酶之前，pH为7.8,KOH浓度为1m。加入DNA溶液或洗脱缓冲液作为阴性对照后，反应管中的颜色应为粉红色，pH值正好在酚红的变色点处。引物等温退火和DNA扩增在62℃下进行50 min。
LAMP扩增子的LFD检测使用市售量尺(Milenia HybriDetect, Milenia Biotec GmbH, Gie?en, Germany)进行，如前所述[15]。简单地说，100μL TBS缓冲液pH 7.4，含1% Tween?20，与2μL LAMP反应溶液混合。将试纸浸入稀释后的LAMP扩增子中，孵育5分钟。
根据德国食品和饲料法[30]，主混合物的组成以及针对凝集素Le1基因的实时荧光定量PCR (real-time PCR, qPCR)方法详见Allg?wer等[15]。采用qPCR方法作为定性比较方法。简单地说，将5μL的样本DNA加入到20μL的主混合物中，然后在实时荧光定量PCR仪(MX 3005P?，Stratagene，通过Agilent Technologies, Waldbronn，德国)中扩增。温度程序如下:1个循环50℃2 min(尿嘧啶- n -糖基酶(UNG)活性)，1个循环95℃10 min (UNG失活和聚合酶活化)，45个循环95℃15 s (DNA变性)和60℃1 min(引物退火和DNA扩增)，最后降至25℃30 s(冷却)。每个循环后记录荧光(6-羧基荧光素(FAM))(吸光度为488 nm，发射光度为517 nm)。
摘要
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材料与方法
结果
讨论
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用结晶紫(CV)、钙黄蛋白、中性红、酚红和现成的主混合物进行LAMP产品的比色检测。CV作为一种三芳基甲烷染料，通过与双链DNA主槽结合，在DNA扩增过程中由无色变为紫色[34]。其他被测试的染料是目标DNA扩增的间接探测器。中性红和酚红作为pH指示剂可用于比色检测，因为在扩增过程中会释放质子，导致pH值降低[33]。钙黄素的荧光特性被游离镁离子的存在所猝灭，在LAMP过程中，游离镁离子被释放的焦磷酸盐络合[32]。所有染料在自己的LAMP主混合物中测试了颜色强度和变化的不模糊性，处理和制备的复杂性，以便在比色检测方法中使用它们(图2)。
比色LAMP检测采用100μM酚红，b 100μM钙黄蛋白，c 100μM中性红，d 500μM CV, e WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix。分析提取的大豆DNA，根据Allg?wer等人[15]精心设计的CTAB提取方案，稀释为1:102至1:10 7。洗脱缓冲液作为无模板对照(NTC)
在本研究中，紫外光下的钙黄蛋白在阴性样品(NTC)和含有大豆DNA的样品之间没有变化(图2b)。中性红色也不能明确区分NTC和大豆DNA(图2c)。CV(图2d)和酚红(图2a)，加入到自己的主混合物中，以及商用的WarmStart比色LAMP 2X主混合物(图2e)显示了NTC和大豆DNA反应之间的明显差异。所有这三种方法都可以通过颜色变化来对稀释10-5的大豆DNA进行视觉检测。由于基于CV的LAMP反应实时检测需要制备反应管，其中包括立即制备CV-亚硫酸钠-β-环糊精溶液，随后在适当的反应管中干燥等分物，因此我们认为CV不适合作为快速检测的检测染料。商用的WarmStart比色LAMP 2X母料和自制的酚红母料易于操作，并取得了显著的颜色变化。因此，使用这两种LAMP主混合料获得了最适合该应用的结果(图2a, e)。
下一步，基于优化的酚红主混合物和商用即用主混合物的比色LAMP在三种食物基质上进行了测试，分别是煮香肠、速溶番茄汤和黑巧克力，其中大豆的含量分别为0、10和100 mg/kg。使用自制的主混合物和酚红，在所有三种食品中，大豆分别在10和100 mg/kg水平与0 mg/kg和NTC水平下获得了从粉红色(阴性)到黄色(阳性)的离散比色区分(图3a)。使用商用即用母料获得了类似的结果(图3b)。然而，负反应(粉色)和正反应(橙色)之间的颜色变化差异不如我们优化的酚红母料明显。尽管现成的主混合剂很方便，但其成分仍然未知。由于已知的成分和负反应和正反应的明确区分，优化的主混合物与酚红被用于以下研究。
a用100μM酚红优化比色LAMP, b用即用型商用LAMP主混合物，根据Allg?wer等人[15]，分别从大豆水平为0、10和100 mg/kg的煮香肠(1)、速溶番茄汤(2)和黑巧克力(3)中提取DNA。洗脱缓冲液作为无模板对照(NTC)
DNA提取实验的主要目的是通过我们精心设计的CTAB裂解、氯仿提取、异丙醇沉淀和使用硅柱(作为参考柱)进行额外纯化来显著缩短提取时间。为此，研究人员测试了不同快速方案在复杂食品基质中检测过敏原的适用性，其中包括使用纤维素滤纸的公开方案[31]，该方案承诺在30秒内裂解和纯化(“30秒试纸法”)。此外，对用于基因组DNA快速裂解和单步纯化的商用EchoLUTION植物DNA试剂盒(BioEcho Life Science)进行了研究。此外，我们结合了快速EchoCLEAN DNA清理试剂盒(BioEcho Life Science)来纯化从我们的CTAB裂解方案中获得的DNA。此外，FastPrep-24高速台式快速裂解均质机与SureFood PREP高级试剂盒(R-Biopharm)联合用于纯化释放DNA的适用性进行了评估。不同的DNA制备方案分别使用纯大豆和煮香肠、速溶番茄汤和黑巧克力中的食品基质进行测试。获得的DNA制剂使用优化的酚红比色LAMP协议进行分析，结果如图4所示。此外，对未加标的基质(煮香肠、速溶番茄汤和黑巧克力)进行了分析，没有检测到与扩增相关的颜色变化(数据未显示)。
DNA提取和纯化方案的比较分析。大豆和食品基质煮香肠，速溶番茄汤，黑巧克力在10和100毫克/公斤的大豆。洗脱缓冲液作为无模板对照(NTC)。CTAB法可作为高纯度DNA的参考方案。“所需时间”是指裂解、DNA提取和纯化所需的时间，如果没有特别说明，则不包括额外准备步骤所需的时间
使用EchoLUTION植物DNA试剂盒进行提取和纯化，大豆阳性样品的颜色没有明显变化，也就是说，无论是从纯大豆还是从复杂食品基质中的大豆中，大豆DNA的数量和/或质量都不够高。在使用CTAB裂解方案提取DNA后，用EchoCLEAN DNA Clean Up试剂盒纯化的DNA也观察到类似的结果。30 s试纸法可以成功地从大豆中分离和纯化DNA，用于LAMP扩增，但在3种复合食品基质中，有2种在LAMP中没有颜色变化，分别用于煮肠和黑巧克力中的大豆。从速溶番茄汤中制备的DNA在扩增前已经引起pH值下降，因此不可能发生与大豆DNA特异性扩增相关的颜色变化。使用高速台式均质机FastPrep-24的提取方法，结合随后使用SureFood PREP高级试剂盒通过旋转过滤柱进行纯化，其结果与长期建立但复杂的CTAB内部参考方法相当。从纯大豆和三种复杂食品基质中提取的DNA在LAMP中通过颜色变化成功检测到(图4)。因此，这种优化的方法可以替代复杂的隔夜CTAB方法，在大约20分钟内分离和纯化DNA，用于大豆比色LAMP。
优化的DNA制备和比色LAMP方案的灵敏度在更大范围的大豆水平(每公斤基质1至100,000毫克大豆)中得到了验证(表1)。在10毫克/公斤(0.001%)的水平及以上，大豆在所有食品中都可以检测到，除了8个加标的速溶番茄汤中的一个反应检测为阴性。在两种独立的DNA制剂(“Iso”)中进行的所有8种LAMP反应中均检测到100 mg/kg(0.01%)至100,000 mg/kg(10%)之间的高大豆浓度。此外，在大豆含量为1 mg/kg(0.0001%)的较低水平下，8个LAMP反应中有7个在黑巧克力中检测出阳性，这表明与煮香肠和速溶番茄汤相比，黑巧克力的敏感度更高(表1)。因此，可以假设每公斤加工食品的可检出性约为10 mg大豆，而巧克力基质的灵敏度可能更高。
优化后的方法(DNA制备和比色LAMP)应用于12种商业加工食品，其中7种在成分表中含有大豆或其制品，2种具有自愿预防性过敏原标签(PAL)，如“可能含有…”，3种根本没有大豆声明。除比色法检测外，还对DNA分离物进行了qPCR分析，并在选定的样品中通过随后的LFD检测LAMP扩增子的存在(表2)。除了一个声明含有大豆成分的样品外，在所有LAMP反应中都检测到大豆，并通过凝集素qPCR证实了这一点。阴性样品中含有酱油成分。在所有反应中，没有任何类型大豆声明的3个样品在LAMP和qPCR中均为阴性。然而，在LAMP中DNA扩增之前，一个样品(“谷物-土豆-西式零食风味”)的反应已经改变了颜色。该样品通过LAMP反应的LFD检测和qPCR验证为阴性。含有大豆PAL的两个样品中的一个(“燕麦粥”)在所有反应中LAMP和qPCR检测均为阴性。另一份含有大豆PAL(榛子饼干)的样品在每次DNA分离和所有应用方法的两种反应中均有一种呈阳性，表明大豆含量较低，接近所有方法的检测极限。总的来说，LAMP得到的结果与根据成分标签预期的大豆存在很好地吻合。此外，进行了两个独立的DNA分离，每个分离都进行了两次比色LAMP检测。每次DNA分离(Iso 1和Iso 2)显示相同的结果，证实了DNA提取方法的重复性。更多细节将在下面的讨论部分中讨论。
一个没有被扩增DNA污染的实验室环境对于基于DNA的检测方法是特别重要的。避免先前分析的扩增产物的反污染是必要的。防止反向污染的最有效措施是对主混合料制备、扩增和检测等关键步骤进行严格的空间分离。此外，在扩增和检测过程中，反应管的永久关闭进一步增加了防止反污染。在基于pcr的方法中，这是通过使用荧光染料进行实时检测来实现的。这种方法也可以应用于LAMP方法，尽管这需要复杂的荧光读取器。另外，在扩增过程中直接变色提供了无污染工作流程的优势，而无需此类额外的实验室设备。在这项工作中，对不同的染料进行了适用性测试。钙黄素作为一种金属离子指示剂，随游离镁离子的浓度变化，其荧光由弱橙色变为强绿色。因此，由于反应过程中释放的焦磷酸盐络合会使镁离子浓度发生变化，原则上可以使用钙黄蛋白进行检测[32]。然而，在我们的大豆特异性LAMP中钙黄蛋白的经验测试并没有区分阳性和阴性反应(图2b)。为了最佳地利用钙黄蛋白，在主混合物和最终反应方法中需要理想的镁离子浓度。然而，不能排除食物基质对镁离子浓度的负面影响。此外，还需要紫外线源来评估结果。使用中性红色作为pH值指示剂基本上会导致颜色变化，但它不够明显，无法进行明确的是或否评估(图2c)。当使用CV，酚红或即用型WarmStart比色LAMP 2X Master Mix时，可以实现阳性和阴性结果之间明确的基于颜色的区分。使用CV的比色检测显示，从无色的浅蓝色到深蓝色的显着颜色变化(图2d)。使用CV的一个明显缺点是制备反应管很费力。由于紫结晶紫的不稳定性，必须重新制备紫结晶紫溶液。如果在LAMP之前没有立即制备CV-LCV溶液，可能会出现颜色波动(细节未显示)。这与CV和LCV之间的动力学平衡有关，随着时间的推移，这种平衡倾向于更稳定的CV[34]。CV通常适用于LAMP产品的检测，然而，易于操作对于快速方法的使用至关重要。此外，CV已被列为致癌物[35]。由于这些原因，在本研究中不推荐使用CV作为检测染料。
如本工作所示，即用型WarmStart比色LAMP 2X Master Mix适用于我们的大豆特异性快速方法。在1:102至1:105的稀释水平下，通过视觉检测成功地对大豆进行了明确的检测(图2e)。一种易于使用的反应混合物的可能性在常规分析中是方便的。然而，这种母版混音的组成是不透明的。此外，我们观察到应用于复杂食品基质时的局限性，从阴性到阳性样品的颜色变化不如纯大豆材料明显(图3b)。这导致我们选择我们自己准备的母料，使用酚红作为指示性检测染料。
酚红作为pH指示剂，非常适合于基于pH依赖性颜色变化的比色检测应用。根据Allg?wer等人的研究，三(羟甲基)氨基甲烷(tris)等pH缓冲物质可以抑制这种变化[14,15]。三(羟甲基)氨基甲烷是主混合物的组成部分。因此，调整主混合物的组成，例如通过省略Tris和添加不同的盐，以获得最佳的颜色变化，同时保持LAMP中的扩增效率。用不同的大豆DNA稀释度对该系统进行了测试。在LAMP终止后，在1:102至1:105的稀释水平下，可以看到明显的颜色变化(图2a)。此外，还成功地将比色法检测应用于三种含有大豆的食品基质，即煮肠、速溶番茄汤和黑巧克力(图3a)。迄今为止，酚红比色LAMP在食品分析领域的应用受到限制。更常见的是，该检测系统用于检测致病性病毒或α-地中海贫血-1等疾病，通过扩增α-珠蛋白基因的特定序列片段，从粉红色到黄色的特定颜色变化[36,37]。这些工作的结果在明确的颜色变化方面与目前的结果相当，表明酚红作为LAMP检测染料也适用于食品中大豆的检测。在我们的应用中，与现成的母料混合物相比，自行开发的酚红母料混合物在复杂食品中提供了相似甚至更好的结果。与LCV相反，苯酚红在正常环境条件下是稳定的，因此不会分解该物质。因此，所有需要的解决方案都可以引用并在较长时间内使用。
根据Allg?wer等人[15]，两个选定的商业试剂盒(EchoLUTION Plant DNA试剂盒和EchoCLEAN DNA CleanUp试剂盒)结合先前广泛的CTAB裂解在测试的基质中没有成功(图4)。根据Zou等人发表的“30秒试纸法”具有极短的性能时间[31]，很有希望。用该方法从大豆中分离和纯化的DNA在LAMP中扩增，目测检测为阳性(图4)。然而，该方法在复杂的食品基质中失败煮香肠，速溶番茄汤和黑巧克力。DNA扩增的失败可能是由于DNA数量不足导致的不理想的裂解或在纯化步骤中没有充分去除抑制剂。在提取过程中，抑制剂(如黑巧克力中的多酚)的共洗脱会降低扩增效率，并导致假阴性结果，这在其他地方得到了测试和证明[38,39]。
使用高速台式均质机，结合使用商用SureFood PREP高级试剂盒进行下游纯化，对不同水平的大豆样品进行快速裂解和提取，获得了明确的阳性结果。从大豆和三种更复杂的食物中提取DNA，在比色LAMP中获得了清晰的结果，与复杂的CTAB法获得的结果相当(图4)。最后，根据SureFood PREP Advanced kit的方案1，通过1分钟的裂解，在大约20分钟内获得了足够高的量和纯度的目标DNA。
与Allg?wer等人相比，优化的提取程序与大豆LAMP方法中的比色检测相结合，显著减少了分析时间，同时避免了后续运行中与先前LAMP产品的潜在反污染。
优化后的DNA提取和LAMP方法分别在煮香肠和速溶番茄汤中检测到10 mg/kg或以上的大豆含量，在黑巧克力中检测到1 mg/kg(表1)。结果与我们之前报道的基于ctab的DNA提取和LAMP- lfd检测方案所获得的结果相同[15]。在经分析的商业食品样本中，在含有大豆、大豆粉、大豆蛋白或大豆卵磷脂为成分的食品样本中检测出大豆(表2)。除一项外，所有标有大豆声明的食品均检测出阳性。这种名为“亚洲风味米饼”的产品含有经过高度加工的酱油，其中可扩增的DNA数量太少。据报道，基于dna的酱油中大豆的检测具有挑战性[40]。不含大豆成分或标有PAL声明的食品检测结果为阴性。有两种食品的标签上写着“可能含有微量大豆”。在其中一个实验中，4个重复中有4个没有检测到大豆，而在第二个实验中，4个重复中有2个检测到大豆。这可能是由于在检测极限下大豆的含量非常少，这在该基质中尚未明确确定。在商业食品样品“谷物-土豆-零食西式风味”的情况下，由于在主混合物中加入DNA溶液后，在LAMP之前已经发生了颜色变化，因此无法对结果进行比色评估。根据SureFood PREP Advanced试剂盒方案1，提取的DNA中的基质成分无法通过纯化去除，导致主混合物的pH值降低，相应的颜色变为黄色。为了解决这个问题，样品可以通过额外的纯化步骤进一步处理(数据未显示)，或者可以通过额外的qPCR检测样品，或者更快速地，通过对现有LAMP扩增子进行10分钟的LFD检测，因为我们的LAMP主混合物中已经使用了生物素化和fitc标记的引物。
在我们之前的研究中，所有零售样本也采用了基于ctab的DNA提取和基于lamp - lfd的检测的详细方案进行分析[15]。值得注意的是，除了一个样本外，我们在本工作中使用优化的DNA提取和检测方案获得了相同的结果。发散样本“巧克力麦片棒”在本研究中LAMP和qPCR均为阴性，而在之前的分析中为阳性。根据成分标签或PAL，食品制造商没有提供大豆存在的迹象。此外，在我们之前的研究中，该样品使用一种商品大豆LFD检测为阴性，而使用另一种商品大豆LFD检测为微弱阳性，这表明大豆的含量非常低，达到或低于约的检测限。2-10毫克大豆每公斤加工食品根据制造商的商业LFD测试[15]。
DNA提取和检测的优化将我们之前发表的LAMP方法[14,15]的样品制备和分析时间减少了几倍，减少到大约。1 h和10 min(图5)。基于蛋白质的大豆检测替代方法是快速定量ELISA或定性LFD[5]，在商用试剂盒的情况下，通常需要大约30分钟(范围5 - 60分钟)来提取和检测蛋白质[9,15]。通过我们优化的方案，我们实现了与商业蛋白质为基础的LFD和ELISA试剂盒相当的快速分析时间。因此，本研究提出的基于dna的大豆LAMP被认为是一种快速的方法。此外，该技术和方案在实验室设备使用有限的情况下易于执行。此外，它遵循“EU指令2010/63”[16]的原则，该指令旨在一旦有替代品可用，就减少和替换动物基试剂，如LFD和ELISA中的动物抗体。
根据德国食品和饲料法[30]，与我们之前发布的LAMP- lfd[15]和凝集素qPCR相比，使用优化的LAMP方案进行样品提取和分析所需的时间
结果表明，优化后的LAMP快速筛选方法适用于各种加工食品样品中大豆的敏感性和特异性筛选。此外，由于优化的DNA提取方法被证明与后续的qPCR分析兼容，因此如果对结果有疑问，可以通过基于lfd的LAMP扩增子检测或正交qPCR进行一般确认。此外，该方法提取的DNA也可用于其他过敏原的检测。总之，我们建议使用我们优化的特异性和敏感性LAMP快速检测各种加工食品中的大豆，作为现场环境(如食品制造)的筛选方法，或者用于鉴定阳性样品，这可能需要使用更复杂和昂贵的技术进行进一步的定量验证。此外，在激发餐中检测过敏原，以确定过敏原特异性免疫治疗前后的阈值，是临床试验的纳入和排除标准，也是过敏原免疫治疗成功的参数，是标准化给药的重要组成部分。因此，我们的新方法也可以通过验证安慰剂餐中活性和无活性的可计算大豆含量来保证临床诊断性食品挑战制剂的质量[6,7,8]。
下载原文档：https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/s00217-023-04334-6.pdf
