寻找减缓衰老和维持人类健康的新干预措施是我们这个时代的巨大挑战。秀丽隐杆线虫提供了一种快速的体内方法来确定化合物是否延长其2至3周的寿命。测量寿命是监测衰老的标准方法，但延长寿命的化合物不一定能保持健康。在这里，我们将秀丽隐杆线虫从成年早期到中年运动的自动监测描述为一种更快的基于健康跨度的测量衰老的方法。使用WormGazer?技术，多个培养皿每个包含几个秀丽隐杆线虫同时和非侵入性成像的相机阵列，可以很容易地缩放。这种方法表明，秀丽隐杆线虫的大多数功能衰退发生在成年后的第一周。我们发现7天的成像足以测量磺胺甲恶唑延缓衰老的剂量依赖性功效，而平行寿命实验需要40天。了解减缓衰老的干预措施的任何负面影响是很重要的。我们发现长寿的突变体age-1(hx546)比野生型保持活跃的时间更长，但在成年早期移动较慢。因此，对运动的持续分析可以迅速确定减缓衰老的干预措施，同时揭示对健康的任何负面影响。
衰老药物的发现面临着特殊而独特的挑战[1]。一个挑战是，目前还没有基于细胞的快速系统来测试一种化合物是否能延缓衰老。相反，基于细胞培养的方法依赖于测量被认为对衰老很重要的细胞生物学方面，即“衰老的标志”[2,3]。这种方法将目标限制在当前知识的范围内，并限制在对培养细胞中可检测的特性起作用的干预措施中。衰老涉及多个生物系统在多个层面(器官、组织、细胞、分子)的相互作用，这只能在整个生物体中看到。在老鼠身上做实验耗时、昂贵，而且受到道德规范的限制。因此，在像秀丽隐杆线虫这样的模式生物中进行测试，为在体内老化系统中快速获得化合物数据提供了机会[4]。衰老药物发现的另一个挑战是，干预措施将长期用于健康人群，因此必须完全安全。任何潜在的副作用都应该在药物发现过程中尽早发现，秀丽隐杆线虫提供了一个快速的早期体内系统来做到这一点。
至少83%的秀丽隐杆线虫蛋白具有人类同源物[5]，其较短的寿命使得研究衰老和药物在衰老生物体中的作用变得更容易。通过对秀丽隐杆线虫的遗传分析发现，胰岛素/IGF-1信号通路(IIS)调节了几个物种的衰老[6,7,8]，这表明至少有一种衰老机制在进化距离中得到了很好的保守。秀丽隐杆线虫也被用来证明许多长寿的突变体经历了生理上的权衡，包括生育力降低或发育迟缓[9,10,11,12,13]。这些发现强调，仅测量寿命不足以了解干预措施是否对人类有益。我们还需要意识到任何对健康的负面影响。
人工秀丽隐杆线虫寿命测定是可获得的，并且很容易在研究小组之间转移，但在实验室之间很难标准化[14]。该试验通过检查蠕虫的运动迹象来收集蠕虫是否活着的二进制数据。如果蠕虫不动，那么用铂金线刺激它以寻找反应。如果没有运动反应，动物就会被标记为死亡。实现自动图像分析的技术可以增加在同一实验中收集的数据量，同时进行更标准化的测量并节省劳动力。这些技术通过测量固体介质[15,16]或微流体环境[17,18]中的运动来评估死亡时间。见“讨论”和表1。
寿命只是衰老的一种间接衡量标准。功能参数，如生殖力、身体弯曲和咽部泵送，告知健康如何随年龄变化，提供健康跨度的测量，并且有技术可以使用成像来测量这些变化[19,20,21]。然而，这些技术要么是侵入性的，因为动物需要移动到设备中进行测试，要么要求动物在其成年后一直保持在微流控设备中，因此处于液体环境中，这与保持在固体环境中的动物产生不同的生理[22]。为了更好地模拟固体介质上的运动，微流体技术加入了微柱，使动物能够在其中穿行[18,23]。
在这里，我们描述了如何在带有活细菌草坪的琼脂填充的培养皿上无创地监测健康，这是秀丽隐杆线虫实验室培养的标准条件。我们将这项技术命名为WormGazer?，它可以同时监测许多培养皿，而无需移动培养皿或相机，使用具有可扩展性的设计。通过监测L4阶段(成年前1天)的蠕虫，并在24°C下进行7-14天的实验运行时间，我们表明，在这一时间段内测量运动可以检测到减缓衰老的药物所带来的健康改善。我们进一步使用药物磺胺甲恶唑(SMX)来表明，在成像的前7天，运动能力下降的延迟是明显的，而在并行的手动实验中，对生存的影响需要数倍的时间。最后，我们测试了报道的延长寿命的化合物α -酮戊二酸。这种方法可以通过提供关于化合物在整个生物体中的作用的快速信息来加速药物的发现，从而允许对领先候选药物进行更明智的决定。
已经设计了多种技术来监测蠕虫的运动。它们主要涉及蠕虫样本(培养皿、多孔板或微流体装置)，这些样本需要在单个固定的高功率相机下按顺序移动以记录图像或视频，或者一组固定的蠕虫样本，相机在它们之间移动(见“讨论”和表1)。这些技术提出了精确和一致地对齐运动部件的挑战。为了同时监控大量蠕虫，我们使用了一组低级摄像机，每个摄像机都连接到自己的单板计算机上。这种没有移动部件的分布式计算方法具有健壮性和可伸缩性。例如，使用以太网可以将数百台单板计算机连接到一台网关计算机上，而使用USB将许多摄像机连接到个人电脑上的扩展限制较低，并且会产生更多空间、布线、冷却和数据处理方面的问题。
WormGazer?设计用于与标准秀丽隐杆线虫实验室培养相同的琼脂培养皿。每个6厘米的培养皿由永久发光的白色LED面板从上方照射，并由其下方的摄像机成像(图1A)。这台相机是由连接的单板计算机控制的。由于温度是秀丽隐杆线虫老化的一个重要变量，并且由于温度的变化会影响培养皿的水分含量，因此，使用通过吹外部冷却空气(例如从空调房间)来抵消灯和电子设备发出的热量的反馈冷却系统，将培养皿的室温度小心地控制在±0.1°C以内。必要时，小型电阻加热器提供额外加热。
WormGazer?原理图。培养皿放置在温控箱中，每个培养皿有一个成像站。这张图表示相机如何定位拍摄图像，并连接到单板计算机。相机每0.8秒拍摄一张图像，持续160秒，每5分钟重复这一过程。第一级图像处理发生在单板计算机上。B 30个L4蠕虫的平板相机透射图像(左)。图像的像素值在每个成像窗口(中左)的200幅图像中平均，产生可以检测到运动的高对比度图像(中右)。动物移动的比例和移动物体移动的速度是两个主要输出(右)
每5分钟，每台摄像机在160秒的时间窗内记录200张图像(每0.8秒一张图像)。蠕虫与其半透明介质之间的对比度允许测量像素值的变化(图1B)。将来自成像窗口的图像在每一帧中进行平均和相减，然后进行叠加，就得到了一幅高对比度的图像，该图像代表了成像窗口中的运动，其中在成像窗口中由于运动而改变了值的像素被表示为白色，未运动的背景被表示为黑色(图1B)。因此，蠕虫在成像窗口内移动的位置和距离取决于这些明亮像素在其质心处的路径[24]。检测的阈值速度设置为10 μ m s?1，以限制相机可以拾取的其他变化对板的噪声，例如细菌草坪中的蠕虫痕迹。偶尔会有一些误报，导致在一个时间点上明显超过100%的蠕虫移动，但这些异常的水平不足以掩盖种群水平上的移动。
所有移动到阈值以上的物体被用来测量蠕虫移动的比例(物体的数量)和蠕虫移动的平均速度(物体的长度)(图1B)。同时记录蜗杆在板上的位置(物体的坐标)。蠕虫检测有一个区域限制，用红圈表示(图1B)。使用一系列连续的图像来检测运动，该系统可以识别在成像窗口期间移动的蠕虫。没有必要跟踪每只蠕虫，因为在种群水平上测量行为变化足以测量衰老。数据分析在本地连接的服务器上进行，并使用Python脚本创建初始数据输出。
一旦实验开始，这些盒子在7到14天的实验期间不受干扰。蠕虫在L4阶段放置在培养皿中，培养皿通常在24.0°C下运行。在这些条件下，野生型蠕虫在24小时内成为成虫，在48小时左右出现运动高峰，然后开始与衰老相关的运动和速度下降。该系统允许在正常的实验室环境中对蠕虫进行非侵入性监测。
为了测试该系统是否能够检测到秀丽隐杆线虫突变体中由于衰老而产生的变化，从而显示出对寿命的影响，我们将长寿的age-1(hx546)和短寿命的daf-16(mu86)突变体的运动与野生型(WT)对照进行了比较。在12天的时间里，每种条件下至少有298只蠕虫在10个培养皿中进行了比较。在培养液中加入2微摩尔氟尿定(FUdR)以防止卵孵化。
在任何时间移动的蠕虫的比例被定义为在160 s成像窗口内移动的蠕虫种群的比例。图形的线条被平滑，平均值的标准误差(SEM)的阴影(图2A)。蠕虫的运动在第2天左右达到峰值，因此这个时间点被认为是与年龄相关的衰退的开始，并被用作曲线下面积(AUC)计算的起点，该计算产生蠕虫在该时间段内移动的平均时间。
年龄1岁、daf-16岁和WT型蠕虫12天的运动分析。A分数移动图显示了扫描电镜遮光成像窗口内蠕虫移动的比例。n≥298只蠕虫，每个条件10-12个培养皿。B 2-7天曲线下的积分面积。C 2-12天曲线下积分面积。一个独立重复的分数移动，用扫描电镜着色。n≥420只蠕虫，每种条件14个培养皿。E a .所有蠕虫的平均移动速度F .所有蠕虫的平均移动速度，是a和E的函数G . 2-12天所有蠕虫的平均移动速度曲线下积分面积(F). DM上FUdR为2μM的培养皿。**=p < 0.01， ***=p < 0.002，单尾检验
与WT相比，1岁突变的蠕虫在第2天和第7天之间的移动时间多了93.5%(图2B)，并且蠕虫继续显示出增加的移动比例，直到实验结束(图2A)。视频显示了两个代表性的培养皿中的运动，说明了这一结果以及该技术是如何工作的(补充视频S1)。有趣的是，在成年早期(0.5天至2天)，当衰老可能不显著时，1岁突变体的移动比例比WT低12.1% (p < 0.05，补充表S1)。这一意想不到的结果表明，与WT相比，1岁突变体在成年早期有更少的移动蠕虫。
与WT相比，daf-16突变体在前7天的平均移动时间没有显著差异，但当计算第2至12天的AUC时，与WT相比，daf-16突变体的移动时间减少了23.2%(图2C)。总的来说，这些结果与age-1突变体的衰老速度较慢一致，因为它比WT保持活性的时间更长，而daf-16的衰退速度比WT更快。数据显示出极好的可重复性(图2D)。
移动蠕虫的平均速度是每个检测到的蠕虫在成像窗口内移动距离的函数(距离/时间=速度，图2E)，并且不考虑在窗口内不移动的蠕虫。它与蠕虫移动的比例无关。在本分析中，1岁突变体在第2天的速度比WT低27% (p < 0.002, Supplementary Table S2)，并且在第1.53天达到最大平均速度，而WT在第1.94天达到最大平均速度(图2E)。同时，WT与daf-16在速度上无显著差异。第10天之后，daf-16没有更多的速度数据，因为至少有一整盘蠕虫没有超过10μm s?1的检测阈值。
将“移动分数”和“蠕虫移动平均速度”参数相乘，得到“所有蠕虫的平均速度”(图2F)。这个图表表示了实验中所有动物的移动速度。在这种情况下，它表明年龄-1突变体的速度峰值较低，但在更高更快的水平上继续移动的时间更长，并且表明daf-16突变体的速度下降比WT更早，更陡峭。这些曲线下的面积表示蠕虫移动的平均距离，并且表明年龄-1突变体移动的距离明显大于WT，但daf-16突变体与WT没有显著差异(图2G)。在补充图S1中可以找到两个重复的完整比较。
为了比较WormGazer?和人工寿命测定之间的运动分析，两种方法并行进行。每种条件制备26个培养皿，30个温敏无菌glp-4(bn2)虫，其中50%在WormGazer?上分析，50%通过人工寿命法分析(每种条件每种方法共设置390只虫)。两种方法均于第7天和第14天将线虫转移到新鲜培养皿中。SMX作为阳性对照。SMX通过抑制OP50大肠杆菌中叶酸的合成，以剂量依赖的方式延长秀丽隐杆线虫的寿命，至少达到256μg/mL。抑制细菌叶酸合成可抑制加速衰老的大肠杆菌活性[25]。在本实验中，我们使用了低浓度的SMX，在之前的研究中，SMX延长了寿命，效果显著(4μg/mL和8μg/mL)或不显著(1μg/mL)[26]。
人工寿命实验(图3A)显示，随着SMX浓度的增加，存活率有统计学意义的增加(所有条件下的p < 0.0001, Wilcoxon检验)。1μg/mL SMX的平均生存期为20天，而4μg/mL和8μg/mL SMX的平均生存期为21天，对照组为18天(补充表S1)。该实验耗时40天完成。
手动寿命与WormGazer?运动分析。将glp-4无菌虫置于L4s上，并于第7天和第14天转移，分别置于WormGazer?或24°C培养箱中。手工寿命法的生存曲线。B蠕虫在WormGazer?上移动的分数。在分数移动图中添加了一个中断轴，以指示蠕虫在前两个实例中转移的时间，而最后一个间隙表示机器重新启动的时间。所有这些例子都在运动中产生了颠簸，通过省略46个成像周期来平滑。曲线下面积的积分C表示第2-22天，D表示第2-7天。E蠕虫移动的平均速度，F所有蠕虫乘以B和E的平均速度。从第7天起，工作日每隔一天进行人工评分。**=p < 0.01， ***=p < 0.002，单尾检验。添加到DM琼脂中的化合物。n≥260只虫，每种条件，每种技术，12个培养皿
在WormGazer?实验中，蠕虫在所有SMX浓度下的运动水平都有所改善(图3B)，从第2天开始具有统计学意义(p < 0.002)(图3C)。值得注意的是，到第7天，差异已经很明显了。第2天至第7天的AUC显示，所有SMX浓度都显著改善了健康寿命(1μg/mL SMX p < 0.01, 4μg/mL和8μg/mL SMX p < 0.002)(图3D)。自动监测还收集了速度数据(图3E, F)，显示SMX条件下蠕虫在第2.5天的平均移动速度明显较慢(p < 0.002，补充表S3)，但SMX显著提高了整个实验的速度(图3F，插入)。
WormGazer?实验只需要在一段时间内干扰蠕虫三次，而人工寿命要求从第7天起每隔一天进行一次。第22天之后，没有检测到超过自动运动阈值的运动，而手动方法可以检测到较小的运动和对刺激的反应，因此持续到第40天。
总的来说，这两种方法显示了类似的结果，但在用户努力和捕获的数据量方面存在很大差异。从第2天到第7天的AUC显示了与40天的人工寿命相同的显著结果，这表明7天的健康跨度可以用来检测寿命延长，而不需要寿命测定的工作和时间。
接下来，我们测试了α -酮戊二酸(αKG)，这是一种克雷布斯循环中的代谢中间体，可以延长秀丽隐杆线虫的寿命[27]。为了了解αKG对衰老的影响，我们在0.5 ~ 8 mM范围内进行了αKG对健康寿命影响的浓度依赖性实验，其中8 mM为报道的有效浓度。我们发现，事实上，8 mM可以显著降低蜗杆运动，而0.5 mM和2 mM则没有影响(图4A)。
-酮戊二酸改善蠕虫健康。蠕虫在-酮戊二酸盐上的分数移动及其曲线下面积的积分(插图)。n≥180只蠕虫，每种条件6-8个培养皿。B分数在较小的浓度范围内移动，通过AUC的积分识别两个正浓度(插图)。n≥330只蠕虫，每个条件11-12个培养皿。C B实验中所有蠕虫的平均速度和AUC的积分(见图)。D重复B的分数移动，显示与AUC积分相同的结果(插图)。n≥300只蠕虫，每种条件10-11个培养皿。E分数在较小浓度范围内移动，通过AUC积分识别出三种正向影响的浓度(见图)。n≥150只蠕虫，每个条件5-9个培养皿。* *=*=p < 0.05, p < 0.01, * * *=p < 0.002,单侧检验。添加到DM琼脂中的化合物。采用温敏无菌glp-4虫
我们将浓度范围收紧至0.5至4 mM，并使用更高的动物数量，发现与对照组相比，2 mM和4 mM αKG在前7天内分别显著提高了12.7%和10.7%的运动能力(p < 0.002，图4B)。此外，4 mM提高了所有蠕虫的平均速度(图4C)。所有实验中蠕虫移动的平均速度见补充图S2。这一发现是可重复的(图4D)。然后在更小的浓度范围内进行分析，发现3 mM和5 mM αKG也能有效改善运动(图4E)。总的来说，通过7天的自动监测实验，我们发现αKG在很小的浓度范围内都能有效地维持健康。
摘要。
介绍
结果
讨论
材料与方法
数据可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
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在本文中，我们已经证明秀丽隐杆线虫的运动数据可以用来测量衰老，并产生在7天内评估化合物和突变体的有用结果。本文介绍的新型WormGazer?自动成像技术使这种方法成为可能，但其他非侵入性地同时监测大量蠕虫运动的技术也可以实现类似的结果。我们表明，种群水平的指标足以提供一种快速测量衰老的方法，并且没有必要解决跟踪单个蠕虫的相当大的挑战。传统的人工寿命测定也不能追踪单个蠕虫的整个生命周期，由于该方法相对容易和可转移性，它已经成功使用了几十年。
老龄化的一个普遍特征是异质性。例如，在任何秀丽隐杆线虫的寿命实验中，第一个蠕虫和最后一个蠕虫的死亡之间存在很大的时间差。因此，测试的蠕虫数量是寿命测试成功的一个非常重要的因素[28]，同样，使用的蠕虫数量是任何衰老测量的重要参数。WormGazer?技术允许设置大量的蠕虫，其方式与寿命分析类似，但在设置之后，除了运行后检查外，不需要进一步的人工操作，数据自动可用。
寿命测定的普遍存在导致寿命几乎与衰老同义。然而，秀丽隐杆线虫在开始成年生活的几天内就失去了最佳健康状况，因此衰老早在死亡之前就发生了。蠕虫生命的最后一周几乎不动，也不吃东西[28]。维持健康和/或预防慢性疾病是该领域许多衰老研究和药物开发的目标，因此直接解决这些终点的检测方法很重要。由WormGazer?收集的运动数据不需要单独进行，也不需要取代寿命分析。相反，它提供了互补的端点。WormGazer?技术的非侵入性意味着，在健康寿命分析后，蠕虫可以转移到新鲜的培养皿中，并且可以对同一动物进行人工寿命分析(或其他分析)。
其他技术已经被设计用来测量老化(表1)。简而言之，第一个主要区别是，WormGazer?使用标准琼脂培养皿和标准蠕虫培养方法来设置，使其能够以与之前大多数线虫研究相同的方式监测蠕虫的行为。此外，它没有可移动的部分(如在WormBot, HeALTH或C. elegans观测站中发现的)，这引入了观察之间变化的可能性，或者需要在相机/显微镜(CeLab)下移动。它有一个内置的温度控制器，专注于蠕虫样本，而不是依赖于外部温度控制(除了健康)。WormGazer?对所有蠕虫样本进行并行成像(与CeLab、WorMotel、WormBot、HeALTH and Lifespan Machine的顺序成像相反)。最后，它不需要运行后的数据管理，除了审查培养皿的任何质量控制失败(例如污染)。总之，WormGazer?的这些特性使该技术与秀丽隐杆线虫的衰老研究非常兼容，因此，在各种条件下监测衰老非常实用。
该表旨在展示文献中报道的自动化硬件和软件技术的范围。根据是否在同一时间点监测所有动物来判断平行成像。手动运行后数据管理被定义为需要手动执行统计或图像分析。数据只需要手动上传到软件管道，或者管道需要手动激活才能启动的技术，不需要手动运行后管理。
在本文中，我们验证了用运动来测量衰老的方法，表明长寿的1岁突变体比我们的实验测量的野生型更能保持运动。同时，我们揭示了该突变体的早期生命运动特征，这与IIS突变体中存在延长寿命的权衡的观点是一致的[8]。
任何测量衰老的方法都必须是可重复的。许多环境和表观遗传因素都会影响健康，因此无论采用何种方法测量衰老，保持非常一致的培养条件和蠕虫制备都至关重要。由于WormGazer?从实验开始就监测蠕虫的运动，因此可以在与年龄相关的衰退开始之前检测到蠕虫行为的任何异常，从而有助于检测准备的质量控制。我们已经证明，WormGazer?的结果具有良好的可重复性(图2和4，补充图S1)。WormGazer?技术背后的软件和原理已获得专利[24]，该技术可以作为商业服务在Magnitude Biosciences获得，使那些没有秀丽隐杆线虫经验的人也可以使用。
使用WormGazer?技术，仅用了7天就看到了SMX的延缓衰老效果。在较宽的浓度范围内缩小后，我们看到αKG的显著改善。这一发现说明了一个观点，即一种化合物的几种浓度应该进行测试，以呈现全貌，而且7天内的自动成像使剂量反应研究比使用寿命分析更快、更容易。该技术的可扩展性，加上以标准化方式生产培养皿和蠕虫的自动化工作流程，允许以多种浓度或组合筛选大量新化合物，以发现减缓衰老和改善人类健康的新干预措施。一旦发现延缓衰老的化合物，秀丽隐杆线虫遗传学的力量就可以用同样的技术来揭示其作用机制。在药物延缓衰老的开发过程中，安全性是一个非常重要的因素。任何长期给健康人服用的药物都必须是非常安全的，监测整个成年早期到中期的运动可以突出任何潜在的负面影响。总的来说，我们表明，随着时间的推移监测大量蠕虫种群的运动是解决发现减缓衰老新药的挑战的有力工具。因此，这些实验是利用运动来衡量健康的概念验证，代表了这种监测技术的一种潜在用途，也可以扩大用于行为、趋化性或毒性分析。
所有菌株均来自由NIH研究基础设施项目办公室(P40 OD010440)资助的隐杆线虫遗传中心(CGC)。使用的菌株为N2、TJ1052 (age-1(hx546) II)、CF1038 (daf-16(mu86) I)和SS104 (glp-4(bn2) II)。glp-4(bn2)蠕虫对温度敏感，无菌，在15℃的允许温度下保持。为了一致性和时间方便，所有其他菌株保持在相同的温度下。
为了准备在WormGazer?上进行实验，将怀孕的蠕虫放置在9厘米的培养皿中产卵，然后放置在机器上4天。48 h后取出母虫，24 h后，将这些9厘米培养皿移至24℃，以确保大量的L4s，或者在SS104 glp-4(bn2)蠕虫的情况下诱导不育。第二天，选择L4期的蠕虫，在每个6厘米的培养皿中挑选30只。每种条件至少准备6个培养皿。这些盘子的边缘覆盖着一层膜，以防止干燥，但留有5毫米的空隙，以供空气交换。然后将盘子装入机器中，在实验期间不受干扰。
培养皿中充满定义培养基(DM)，其中将标准线虫生长培养基[34]中的蛋白胨替换为定义的氨基酸和微量金属，以最大限度地减少之前描述的[25]中添加维生素B12[35,36]的蛋白胨批次间变化。在加入蠕虫前3天，用DM琼脂倒入成像用培养皿。在终板浓度为2μM时加入FUdR，以防止所有对温度不敏感的菌株产生后代。所有其他化合物在所需溶剂的100倍原液中组成，并在倒入培养皿之前加入琼脂。第二天，在培养皿中接种100μL LB中过夜培养的OP50大肠杆菌。培养皿在20°C和湿度控制下保存，直到细菌播种后24 h，然后转移到24°C的培养箱中。
每台相机每0.8秒拍摄一张图像，持续160秒，形成一组200张图像，并存储在单板计算机上。这些图像在单板计算机上被转换成一系列的分析图像，这些图像被传送到中央服务器。5分钟后，重复该过程。从这些分析图像中，通过应用每个物体的最小速度为10 μ m s?1的阈值来计算移动物体的数量。速度由物体的长度除以成像窗口的160-s时间间隔得出。如果培养皿在实验结束后没有通过质量控制检查，比如它们被其他微生物污染了，或者蠕虫在琼脂中钻了洞，那么培养皿就会被审查。在数据分析中省略了截尾板。
SS104 glp-4(bn2)蠕虫的制备方法与healthspan实验相同。选择L4条蠕虫并将其挑选到培养皿中，每皿30条蠕虫，每皿12条。从第7天开始，每个工作日每隔一天对蠕虫进行评分，并标记为活的、死的或被审查的。蠕虫在被标记为死亡之前，用一个白金的镐头来戳它，检查它的活动情况。蠕虫在第7天和第14天转移。审查表明，这些蠕虫已经装袋、破裂外阴或爬出盘子。在GraphPad Prism上生成Kaplan-Meier曲线，在JMP统计软件上进行统计。
时间序列曲线上的阴影是该条件下每个培养皿曲线上平均值的1个标准误差。条形图上的误差柱是在该条件下每个碟的测量平均值的±1个标准误差。当比较柱状图上的两个条件时，计算平均值之间的差异，并使用高斯误差统计，参照每个单独测量的标准误差计算其标准误差。然后根据用标准误差表示的差异来设置显著性阈值。小于1.64个标准误差的差异被标记为不显著(ns)。标准误差1.64和2.33之间的差异用一星(*)表示，对应于单侧检验的p < 0.05。标准误差2.33和2.83之间的差异用两颗星(**)表示，对应于单侧检验的p < 0.01。在单侧检验中，差异大于2.83标准误差的标记为三星(***)，对应于p < 0.002。
以下是电子补充材料的链接。
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